Tổng Hợp Peptide Pha Rắn Siêu Hiệu Quả (UE-SPPS)

Tổng Hợp Peptide Pha Rắn Siêu Hiệu Quả – UE-SPPS là một hướng tiếp cận đột phá trong sản xuất peptide, giúp loại bỏ hoàn toàn các bước rửa resin vốn thường được yêu cầu trong các phương pháp tổng hợp peptide pha rắn truyền thống.

Việc loại bỏ hoàn toàn bước rửa đạt được nhờ sự kết hợp giữa quá trình dập tắt tại chỗ lượng amino acid monomer đã hoạt hóa dư thừa và quá trình bay hơi có kiểm soát lượng base khử bảo vệ dư. Tất cả các phản ứng, bao gồm coupling và khử bảo vệ, đều được tăng cường bằng chiếu xạ vi sóng tối ưu, hỗ trợ tổng hợp peptide và protein chất lượng cao, kể cả các trình tự dài lên đến 100 amino acid.

Nhờ đó, UE-SPPS có thể giảm đến 95% tổng lượng chất thải phát sinh so với phương pháp SPPS thông thường. Một bài báo về cải tiến này gần đây đã được công bố trên Nature Communications. Có thể xem toàn bộ bài viết tại đây.

UE-SPPS là một bước tiến quan trọng trong tổng hợp peptide và hiện có trên các hệ thống Liberty Blue 2.0 và Liberty PRIME 2.0 của CEM. Khám phá các lợi ích và công nghệ nền tảng của UE-SPPS bên dưới.

Trong một nghiên cứu đã công bố, bộ 20 peptide neoantigen với trình tự đa dạng và độ dài trung bình 16 amino acid đã được tổng hợp bằng Liberty PRIME 2.0 kết hợp HT24. Tổng thời gian tổng hợp cho toàn bộ bộ peptide là 24 giờ 14 phút. Các peptide được tổng hợp ở quy mô 0,1 mmol sử dụng CarboMAX™, cho peptide thô với độ tinh khiết từ 47% đến 90%, độ tinh khiết trung bình 69%. Tổng lượng DMF sử dụng là 6056 mL và tổng lượng chất thải phát sinh là 6979 mL. Các peptide neoantigen này sau đó được tinh sạch thêm bằng sắc ký ở nhiệt độ cao để đạt độ tinh khiết phù hợp cho các nghiên cứu sinh học.

Độ tinh khiết vượt trội

Xả khí khoảng không đầu bình

Gia nhiệt vi sóng thúc đẩy quá trình khử bảo vệ Fmoc diễn ra hoàn toàn.
Khí nitơ (N₂) được đưa vào bình phản ứng.
Base khử bảo vệ bay hơi nhờ gia nhiệt vi sóng.
Hỗn hợp nitơ (N₂) và base khử bảo vệ được dẫn ra khỏi bình phản ứng đến đường thải.
Các thuốc thử còn lại và sản phẩm phụ được lọc ra đường thải.

JR 10-mer

Môi trường phản ứng sạch hơn, peptide tinh khiết hơn

Công nghệ Headspace Gas Flushing được cấp bằng sáng chế của CEM giúp loại bỏ base khử bảo vệ dễ bay hơi khỏi khoảng không đầu bình phản ứng trước khi chúng có thể ngưng tụ trên bề mặt phía trên của bình.

Sự ngưng tụ của base và việc dung dịch phản ứng đi ngược trở lại vào mẫu có thể ảnh hưởng đáng kể đến độ tinh khiết của quá trình tổng hợp, đặc biệt với các chuỗi peptide dài, nơi chỉ một lượng nhỏ tạp chất cũng có thể nhanh chóng tích lũy.

Việc loại bỏ hoàn toàn base khử bảo vệ khỏi cả dung dịch phản ứng và khoảng không đầu bình còn mang lại một lợi ích quan trọng khác: giảm nhu cầu thực hiện các bước rửa bình lặp lại nhiều lần. Tiếp tục tìm hiểu để xem thêm các lợi ích về hiệu quả quy trình.

R = Mạch nhánh amino acid
Y = Nhóm bảo vệ mạch nhánh
A = OH, NH

Coupling CarboMAX²

Khi độ tinh khiết tổng hợp là yếu tố quan trọng, chiến lược coupling cũng quan trọng không kém

Các phương pháp coupling thúc đẩy bởi carbodiimide mang lại nhiều lợi thế so với các phương pháp coupling dùng muối onium, ví dụ HBTU/DIEA, đặc biệt khi thực hiện ở nhiệt độ cao.

Lợi ích của phương pháp carbodiimide bao gồm khả năng giảm đáng kể tỷ lệ enol hóa/epimer hóa, đồng thời hạn chế các phản ứng phụ do base xúc tác.

So sánh độ tinh khiết peptide thô giữa phương pháp tiêu chuẩn và CarboMAX

Peptide	Trình tự	Tiêu chuẩn	CarboMAX
Thymosin	SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN	63%	75%
GRP	GRPVPLPAGGGTVLTKMYPRGNHWAVGHLM	62%	74%
Bivalirudin	fPRPGGGGNGDFEEIPEEYL	80%	82%
^1-34PTH	SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF	67%	85%
^35-55MOG	MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK	77%	91%
Magainin 1	GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS	71%	79%
Dynorphin A	YGGFLRRIRPKLKWDNQ	74%	82%
Liraglutide*	HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(γ-Glu-palmitoyl)EFIAWLVRGRG-OH	74%	88%

* Được tổng hợp với resin Fmoc-Gly-Wang PS ở mức khoảng 0,32 mmol/g.

Tối ưu từng bước phản ứng bằng công nghệ vi sóng

Chiếu xạ vi sóng là công nghệ đã được ứng dụng rộng rãi để nâng cao độ tinh khiết của peptide được tổng hợp bằng phương pháp tổng hợp peptide pha rắn – SPPS. Công nghệ này đã được mô tả trong hàng trăm công bố khoa học trên toàn thế giới.

Là đơn vị tiên phong toàn cầu trong lĩnh vực SPPS vi sóng, CEM đã giới thiệu hệ thống tổng hợp peptide vi sóng tự động đầu tiên trên thế giới vào năm 2003.

Hiệu quả vượt trội

Giảm lượng chất thải, không đánh đổi hiệu suất và độ tinh khiết tổng hợp

Bằng cách sử dụng phương pháp coupling thúc đẩy bởi carbodiimide, quy trình UE-SPPS loại bỏ nhu cầu rửa sau bước coupling. Lượng amino acid đã hoạt hóa còn dư sau coupling sẽ được dập tắt bởi base khử bảo vệ được thêm vào ở bước tiếp theo, trước khi các phản ứng phụ có thể xảy ra. Dựa trên nguyên lý này, UE-SPPS sử dụng quy trình “one-pot” cho bước coupling và khử bảo vệ. Một lượng nhỏ dung dịch khử bảo vệ được thêm trực tiếp vào dung dịch coupling hiện có, giúp giảm gần 50% nhu cầu dung môi kết hợp cho hai phản ứng. Nói cách khác, dung môi từ bước coupling được tái sử dụng trong bước khử bảo vệ tiếp theo.

Chu trình SPPS truyền thống

Tạo nhiều chất thải do các bước rửa lặp lại

Chu trình UE-SPPS

Không phát sinh chất thải từ bước rửa

Thông qua việc phát triển công nghệ Headspace Gas Flushing — quy trình dựa trên bay hơi đã mô tả ở trên — UE-SPPS cũng loại bỏ nhu cầu rửa sau bước khử bảo vệ. Base khử bảo vệ dễ bay hơi, cụ thể là pyrrolidine, được bay hơi nhanh khỏi bình phản ứng ở nhiệt độ trên 90 °C, đồng thời diễn ra cùng bước khử bảo vệ nhanh có hỗ trợ vi sóng. Quá trình xả khí khoảng không đầu bình giúp ngăn base khử bảo vệ đã bay hơi ngưng tụ trên các bề mặt phía trên của bình phản ứng. Kết hợp lại, các quá trình này giúp peptidyl resin sẵn sàng cho phản ứng coupling tiếp theo mà không cần bước rửa.

Nhờ sự kết hợp giữa tối ưu phương pháp, lựa chọn thuốc thử và các cải tiến kỹ thuật, UE-SPPS giúp giảm lượng chất thải phát sinh lên đến 95%, đồng thời vẫn duy trì hiệu suất tổng hợp và độ tinh khiết của peptide.

Chỉ tiêu	SPPS truyền thống	UE-SPPS
Chất thải trên mỗi lần bổ sung AA*	100 mL	< 5 mL
Chất thải cho peptide 10-mer*	1 L	< 50 mL

* Quy mô 0,1 mmol

Tiết kiệm thời gian rõ rệt

UE-SPPS không chỉ hiệu quả trong việc giảm lượng chất thải tạo ra, mà còn tối ưu cả thời gian thực hiện. Thông qua sự kết hợp chiến lược giữa tối ưu phương pháp, lựa chọn thuốc thử và các cải tiến kỹ thuật, UE-SPPS có thể giúp giảm thời gian tổng hợp lên đến 95%.

Chỉ tiêu	SPPS truyền thống	UE-SPPS
Thời gian cho mỗi lần bổ sung AA*	2 giờ	< 4 phút
Thời gian cho peptide 10-mer*	20 giờ	< 40 phút